A 16. században egy rendkívül érdekes jelenség érkezett Gyulafehérvárra, amely megváltoztatta a nyugati kultúrát, a művészettől kezdve a filozófián át a vallásig. Ez volt a reneszánsz a maga egyszerű, de harmonikus és elegáns formáival. Az ősi eszméket és tudást újra a figyelem középpontjába állította, keresztény, humanista szemszögből értelmezve.

Erdélyben az iskola volt az a hely, amely az új szellemiség bevezetését elősegítette az egyház és a főpapok közvetlen felügyelete alatt. Így nem meglepő, hogy 1520 után Várdai Ferenc püspök és Szeremlyéni Ferenc prépost a reneszánsz építészet szellemében átalakításokat hajtott végre a palotán: módosított homlokzatok, új, a püspök címerével jelölt ablakkeretek, a homlokzatok alján kiemelkedő díszes vakolatdomborművek, az úgynevezett kváderezés.

1542-ben, az utolsó középkori római katolikus püspök, Statileo János halála után a püspöki palotát az erdélyi országgyűlés Izabella magyar királyné és csecsemő fia, Zsigmond János számára lakóhelyül jelölte ki, akit a szultán Budáról az erdélyi Gyulafehérvárra száműzött. A királyné rezidenciája később több mint 150 éven át fejedelmi palotává alakult át. A királynő nagyra értékelte a reneszánsz építészetet, és bevezette a palota bővítési munkálataiba azon rezidenciák mintáját, ahol élete egy részét töltötte — a krakkói Wawel-kastély és a budai királyi palota. A palota a nyugati oldalon a régi római kori erőd faláig nyúlik.

Ezt követték, egymás után a különböző beavatkozások, amelyek a palotaegyüttest annak minden égtájára kiterjesztették, majd drámai események romba döntötték (1600-1603). Egy fejedelem, egy változás. Zsigmond János (1559-1571), Izabella fia a komplexum első udvarára összpontosított, amelyet dél és kelet felé bekerített. Aztán jön a katasztrófa és a palota romba dőlése.

A késő reneszánsz korban, amely egybeesett a legjelentősebb erdélyi fejedelmi családok — Báthory, Bethlen és Rákóczi — időszakával, a palota felülete az új státusszal jelentősen megnőtt. Báthory Zsigmond (megszakításokkal 1586-1602 között) és Bethlen Gábor (1613-1629) fejedelmek idején a palota hamvaiból emelkedik ki, és észak-déli irányban a gótikus (középkori) szárnyig terjed az épületegyüttes nyugati oldalán, ahol az egykori püspöki székhely volt.

Szintén az egy fejedelem, egy változás eszméje alapján I. Rákóczi György (1630-1648) uralkodása idején a mai múzeumnak otthont adó épületben jelent meg az országgyűlési terem és a Tábla, a fejedelemség legfelsőbb jogi fóruma. A terveket Bethlen Gábor készítette.